Jak zastosować siRNA…

wywiad z prof. dr. hab. Jakubem Gołąbem z Zakładu Immunologii Centrum Biostruktury AM w Warszawie

Pod koniec ubiegłego wieku dwaj Amerykanie – Andrew Z. Fire i Craig C. Mello – dokonali odkrycia, za które w 2006 roku przyznano im Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny. Czym jest mechanizm interferencji RNA?

To bardzo specyficzny mechanizm, którego zadaniem jest hamowanie wytwarzania różnych białek w organizmie. To cenne narzędzie dla naukowców – na razie służące głównie celom badawczym, ale mamy nadzieję, że już wkrótce będzie je można wykorzystać w terapii wielu chorób. Samo zjawisko biologiczne zostało opisane znacznie wcześniej przez innych Amerykanów, którzy chcieli, by purpurowe petunie były jeszcze bardziej purpurowe i do komórek kwiatowych wprowadzili dodatkowe kopie genów. Okazało się, że niektóre petunie zamiast mocniej spurpurowieć zrobiły się białe, czyli zostały pozbawione pigmentu. Przypuszczano wówczas, że te dodatkowe kopie materiału genetycznego mogą blokować wytwarzanie naturalnego pigmentu w komórkach kwiatowych. Natomiast Fire i Mello wykazali, że zjawisko wyciszania genów zachodzi przy udziale specyficznego RNA. I zaprojektowali specjalne sekwencje RNA, które to naturalne zjawisko imitowały: siRNA – krótkie interferencyjne (short interferent) RNA.

Po co „wyciszać” geny?

W sytuacji doświadczalnej – żeby zablokować wytwarzanie konkretnego białka i obserwować, co się z nim będzie działo, czyli jaka jest jego funkcja. Musimy pamiętać, że choć niedawno udało się badaczom poznać cały genom człowieka, to nadal nie znamy funkcji wielu genów, których produktami w naszych komórkach są właśnie białka. Natomiast w sytuacji klinicznej staramy się wyciszać geny, by działać terapeutycznie.

A jak się to robi?

Ten kwas nukleinowy z reguły występuje w naszym organizmie w postaci jednej nitki nukleotydów, które powtarzają się w ustalonej sekwencji. Należy zaprojektować specyficzną, podwójną nić RNA, czyli siRNA, po czym wstrzyknąć to do organizmu albo dodać do hodowli komórek. W bardzo dużym uproszczeniu:
siRNA wnika do komórek i wiąże się z nicią mRNA, z którego powstaje w komórce białko, a następnie precyzyjnie blokuje wytwarzanie konkretnego białka. Ta precyzja wynika z tego, że aminokwasy, z których składa się każde białko, są kodowane przez określone trójki nukleotydów. Obliczono, że dowolny 20-nukleidowy fragment pojawia się tylko jeden raz w naszym genomie. A więc jeśli zaprojektujemy siRNA, które ma 21 nukleotydów, wiadomo że przyczepi się ono tylko do jednej nici – tej właśnie, na której nam zależy.

Co to oznacza w praktyce?

W chorobach dochodzi do zaburzonego wytwarzania białek, np. powstaje za dużo danego białka albo w wyniku mutacji, czyli uszkodzenia genu, powstają białka, które mają nieprawidłową budowę i z tego powodu szkodzą. Teoretycznie możemy ten proces zablokować. Wyobraźmy sobie bardzo prosty układ choroby: jest gen, z niego powstaje mRNA, z mRNA powstaje białko, które jest przyczyną choroby. Wykorzystując interferencję RNA i blokując syntezę tego białka pozbywamy się choroby. Przeważnie jednak choroby spowodowane są przez zaburzeniem syntezy wielu różnych białek.

Nieprawidłowe białka pojawiają się np. w chorobach nowotworowych. Jak powstają nowotwory?

W tej chwili wiemy, że dzieje się to w wyniku uszkodzeń materiału genetycznego przez rozmaite kancerogeny: substancje, które spożywamy, promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe, reaktywne formy tlenu, które powstają podczas oddychania komórek. Dzieje się tak bardzo rzadko, bo nasze komórki potrafią uruchamiać enzymy naprawiające uszkodzenia. Ale niekiedy mechanizmy naprawcze zawodzą i jeżeli komórka z uszkodzonym DNA podzieli się – powstaje mutacja, czyli zmiana w strukturze DNA, którą dziedziczą wszystkie komórki potomne.

Zdecydowana większość mutacji w naszych komórkach jest zupełnie nieszkodliwa. Ale jeśli zachodzi w krytycznym miejscu, w określonym genie – może doprowadzić do powstania białka, które komórkę przeobraża w nowotworową. Dziś wiemy, że proces transformacji nowotworowej komórek trwa u człowieka nawet do kilkudziesięciu lat, a do powstania złośliwych komórek niezbędne jest powstanie wielu mutacji, w tych
właśnie krytycznych genach. Tych zmutowanych genów nowotworowych poznajemy coraz więcej i możemy myśleć o zablokowaniu ich produktów, czyli białek, przy pomocy siRNA.

To jedno z najbardziej spektakularnych, ale nadal tylko potencjalnych zastosowań interferencji RNA – nie wiemy, czy będzie działała u ludzi. Ale nadzieje są ogromne i mamy pierwsze dowody na to, że w warunkach hodowli komórkowych mechanizm działa – blokuje ich podziały albo zmusza je do „popełnienia samobójstwa”. siRNA wstrzyknięte zwierzętom doświadczalnym, które mają rosnące nowotwory, też daje efekt terapeutyczny.

Trzeba dodać, że w przeszłości wiele terapii skutecznych w próbach na zwierzętach, w badaniach klinicznych nie spełniało oczekiwań.

Czy mechanizm interferencji RNA może mieć w zastosowanie w leczeniu innych chorób?

Są próby leczenia chorób wirusowych. Tutaj zjawisko interferencji RNA może mieć podwójne znaczenie. Po pierwsze, nie mamy leków przeciwko grypie, HIV, zakażeniu wirusem Epsteina-Barra itd. Pojawienie się wirusa w organizmie człowieka związane jest z obecnością zupełnie nowych dla niego białek – wirusowych. Jeśli przy użyciu siRNA moglibyśmy zablokować wytwarzanie wyłącznie białek wirusa nie blokując ludzkich, to teoretycznie, możemy się spodziewać, że taka terapia nie będzie miała działań niepożądanych. Już trwają próby kliniczne w leczeniu wirusowych zapaleń górnych dróg oddechowych.

Jak rozumiem, potencjalna terapia przeciwnowotworowa musiałaby być bardzo zindywidualizowana, dostosowana do pacjenta i nowotworu, a w przypadku wirusów – do wirusa, czyli pozytywne badania kliniczne mogą prowadzić do powstania konkretnych leków…

Nie ma dwóch identycznych nowotworów. Ale pewne mutacje będą wspólne. Można powiedzieć, że w jakimś odsetku, np. raka jelita grubego, obecna jest mutacja konkretnego genu. Więc w przyszłości terapia z użyciem siRNA polegałaby na określeniu, które nieprawidłowe białka są wytwarzane u danego chorego. Temu prawdopodobnie będą służyć mikromacierze DNA.

A co to jest?

To takie czipy genowe, maleńkie płytki pokryte sekwencjami kwasów nukleinowych, w których znana jest
kolejność nukleotydów. Mówiąc w wielkim uproszczeniu, na taki czip nakłada się kroplę krwi pacjenta (wcześniej odpowiednio spreparowaną) i do obecnych na czipie sekwencji doczepiają się geny pacjenta. Te sekwencje można tak zaprojektować, by wychwytywały zmutowane geny. Oczywiście wszystkich możliwych mutacji jeszcze nie znamy, ale nauka się rozwija i za jakiś czas będziemy mogli w tym krótkim teście badać je i zależnie od wyników projektować siRNA. Będzie to oczywiście terapia celowana, indywidualna dla każdego pacjenta, ale na najczęstsze mutacje będzie można przygotować gotowe leki i przepisywać je w odpowiednim typie nowotworu.

Miejmy nadzieję, że tak będzie, ale… bardzo podobne substancje terapeutyczne, tzw. oligonukleotydy antysensowne, były już testowane u ludzi i niestety wyniki kliniczne bardzo wszystkich rozczarowały. W tej chwili zarejestrowany jest tylko jeden lek oparty na nukleotydach, leczący zapalenie gałki ocznej na tle cytomegalowirusowym. I też brak dowodów, że ten oligonukleotyd specyficznie hamuje jakieś białka wirusowe. Być może bardziej pobudza odpowiedź immunologiczną niż hamuje replikację wirusa.

Tyle znaków zapytania. Za co więc ten Nobel?

Wiemy w tej chwili, że każdy z nas ma niecałe 30 tys. genów, ale znamy funkcje nieco ponad połowy z nich. Druga jest ogromną zagadką. Mając takie narzędzie jak interferencja RNA, możemy zablokować wytwarzanie produktu konkretnego genu, czyli zobaczyć, jaka jest jego funkcja. Mało tego, dzięki użyciu siRNA
możemy, blokując wytwarzanie niektórych białek, sprawdzać, czy uwrażliwia to komórki nowotworowe na chemioterapię, radioterapię i inne klasyczne metody leczenia.

W tej chwili są dostępne „biblioteki”, w których możemy kupić sekwencje siRNA do blokowania ekspresji każdego produktu genów człowieka. A gdy wiemy co blokujemy i widzimy co się potem dzieje, możemy szukać nowych celów dla rozmaitych leków.

Można też próbować wyłączyć funkcje układu odpornościowego, żeby np. zapobiegać odrzucaniu przeszczepów, wytłumić reakcje alergiczne. Potencjalnych możliwości zastosowania siRNA jest tak dużo, że coś musi w przyszłości zadziałać.

Dziękuję za rozmowę.
Wywiad przeprowadziła
Ewa Barciszewska